:: POLIMERAZ ZINCIR REAKSIYONU
7.8.1. GIRIS
Ilk kez 1985'de bilim dünyasina sunuldugundan itibaren polimeraz zincir reaksiyonu (PCR); hem arastirmada hem de klinik laboratuarlarda tanida yeni bir çigir açmistir. ABD'de Cetus Corporation'da çalisan Henry A. Erlich, Kary Mullis ve Randall K. Saiki tarafindan gelistirilmistir. Metod basitçe tüpte nükleik asitlerin uygun kosullarda çogaltilmasidir.(Science,1985:230,1350). Bu bulusundan dolayi K.Mullis, 1993 yili Nobel Kimya Ödülüne hak kazanmistir.
PCR, bir çesit "in vitro klonlama"dir. PCR, reaksiyonu DNA'nin iki zincirinin yüksek isi ile birbirinden ayrilmasini (denatürasyon); daha sonra sentetik oligonükleotidlerin hedef DNA'ya baglanmasini(hibridizasyonu); sonra zincirin uzamasini (polimerizasyonu) (çift iplikçikli DNA'larin sentezi) ve bu sikluslarin belirli sayida tekrarlanmasina dayanir. Bu üç adim (denatürasyon / primer baglanmasi / DNA sentezi) bir PCR siklusunu olusturur. Her adim farkli isilarda gerçeklestirilir. (Sirasiyla 94°C-98°C; 37°C-65°C; 72°C ). PCR teknigi tek veya çift iplikçikli DNA'yi; RNA'ya hedef olarak kullanabilir (Sekil 7.13, Sekil 7.14 ve Sekil 7.15).
Bu teknikle; bir DNA hedefini 106-1012 arasinda çogaltmak mümkündür. Bu teknigi anlattikça; yüzyilin en önemli buluslarindan birisi oldugu kolaylikla anlasilacaktir. Yöntemin temeli, çogaltilmak istenen bölgenin iki ucuna özgü, bu bölgedeki baz dizilerine tamlayici bir çift sentetik oligonükleotid primer (18-20 baz uzunlugunda) kullanilarak; bu iki primer ile sinirlandirilan genin enzimatik olarak sentezlenmesine dayanir.
PCR teknigi, çok az miktarda DNA ile çalismaya olanak saglamaktadir. PCR teknigi ile laboratuvar tanisinda çok büyük bir hiz ve kesinlik kazanilmis; bir çok durumda radyoaktivite kullanimini gereksiz hale gelmistir. PCR Teknolojisi için:
1) DNA örnegi, genelde genomik DNA,
2) Çogaltilacak olan bölgeyi sagdan ve soldan çevreleyen bir çift sentetik primer,
3) dNTP'ler (A,T,C,G),
4) Isiya dayanikli DNA-Polimeraz enzimi,
5) Uygun pH ve iyon kosullarini (Mg+2) saglayan tampon karisimi gereklidir.
Sekil 7.13. Polimeraz zincir reaksiyonunun sematik olarak görünümü.
Sekil 7.14. Polimeraz zincir reaksiyonunu olusturan komponentler
Sekil 7.15. Polimeraz zincir reaksiyonu sonucu elde edilen ürünün agar jel elektroforezinde görünmesi (Beta globin geni, 3. ekson,509 bp).
PCR'nin orijinal protokolünde E.Coli DNA polimerase I'in Klenow Fragment'i birlesen oligonükleotidlerin polimerizasyonunda kullanilmistir. Ancak DNA'yi denatüre etmek için gerekli olan isiya ulasildiginda; enzim inaktive olur. Her ne kadar bu yöntem 200 bp altindaki reaksiyonlar için iyi çalismissa da; uzun segmentlerde yürümemistir. PCR ürünü çok iyi olmayip; mispriming (primerin yanlis bölgeye yapismasi) olayina bagli olarak-farkli büyüklüklerde PCR ürünü elde edilmistir. Bu tip problemler isiya dayanikli Taq Polimerazlarin bulunmasi ile önlenmistir.
7.8.2. ILK BIRKAÇ SIKLUS
Ilk birkaç siklus, spesifik DNA parçalarinin hedef DNA'da yapisabilecekleri yerleri tarama fazidir. Amplifikasyon daha sonra baslar. PCR'in tüm sikluslari, bir önceki siklusda sentezlenen örneklerin denatürasyonu ile baslar. Ilk birkaç siklusun optimizasyonu, çok az miktarda DNA örnegi ile yola çikilan durumlarda (tek hücre veya parafin bloklardaki doku); tarama olayi asiri miktarda sarf malzemesine karsin az DNA'ya karsi olusmaktadir. Az DNA'nin bulunmasi PCR'in tarama fazinda primer ile DNA'nin birbirleri ile karsilasma sanslarini azaltir. Öyle ki primer-primer karsilasmalari daha fazla olur. Bu ise primer dimerlerini ve diger artefaklarin olusmasina yol açar. Bu problemi ortadan kaldirmak için Booster PCR kullanilmistir. Ilk bir kaç siklusda primer dilüe edilerek reaksiona konur, daha sonraki sikluslarda ise primer miktari arttirilarak reaksiyona eklenir.
7.8.3. PCR KULLANIM ALANLARI:
PCR'in baslica kullanim alanlari su sekilde siralanabilir:
1. Kalitsal hastaliklarda tasiyicinin ve hastanin tanisi,
2. Prenatal tanida,
3. Klinik örneklerde patojen organizmalarin saptanmasi,
4. Adli tipta,
5. Onkogenesisin arastirilmasinda,
6. Probe'larin olusturulmasinda/klonlamada/gen expresyon arastirmalarinda,
7. DNA dizi analizinde, büyük miktarda DNA örneklerinin olusturulmasinda,
8. Bilinmeyen dizilerin tayininde,
9. Geçmis DNA'nin incelenmesi ve evrimin aydinlanmasinda,
10. Restriksiyon Fragment Length Polimorfizm Analizinde,
11. Invitro fertilizasyon yapilan tek hücrede, implantasyon öncesi genetik testlerin yapilmasi ve sonra implantasyon gerçeklestirilmesi ile bebegin normal dogmasinin saglanmasi,
12. DNA protein interaksiyonunun arastirilmasinda (footprinting) kullanilabilir.
7.8.4. MUTASYONLARIN ANALIZINDE PCR
PCR tekniginden yola çikilarak gelistirilmis teknikler, mutasyon analizinde kullanilir hale gelmistir. Baslicalari sunlardir:
1. Direk Restriction Endonükleaz kullanilarak
2. Allele-spesifik Oligonükleotidler'in kullanimi (ASO): Hibridizasyonda iki oligonükleotid kullanilir. Amplifiye edilmis DNA, bir naylon membran üzerine konduktan sonra ayri ayri bu oligonükleotidler (radyoaktif veya nonradyoaktif) ile hibridize edilir. Bu oligonükleotidlerin dizileri birbirlerinden mutasyona uygun tek nükleotid degisikligi ile ayrilirlar (Sekil 7.16).
Sekil 7.16. Allel-spesifik oligonükleotidlerin mutasyon analizinde kullaniminin sematik olarak görünümü
3. ARMS Teknigi veya PASA Teknigi
4. Reverse Dot-Blot Yöntemi. Mutasyona uyan oligonükleotidler ve normal DNA dizisine uyan oligonükleotidler (toplumdaki siklik önemlidir) nitrosellüloz/naylon membrana konurlar. Amlifiye edilen DNA isaretlenerek-hibridizasyona sokulur.
5. PCR-SSCP Teknigi.
6. Single spesifik Primer-PCR (SSC-PCR),
7. Delesyon analizinde PCR
8. Multipleks PCR
9. Inverse PCR
10. RNA PCR
11. Denatüring gradient gel elektroforezi
12. Füzyon genlerin analizi
13. Kromozomal translokasyonlarin analizi
14. DNA dizi analizi
15. Diger PCR'a dayali teknikleri
7.8.5. PCR YAPILIRKEN LABORATUARDA DIKKAT
EDILMESI GEREKENLER
PCR, tek bir molekül DNA'yi dahi çogaltabileceginden; reaksiyon karisimlarinin DNA molekülleri ile kontamine olmasinin engellenmesi gerekmektedir. Bu kontaminasyon; daha önceki PCR reaksionu (product carryover), eksojen DNA veya diger hücresel materyelden kaynaklanabilir (Sekil 7.17).
1. Mümkünse, PCR'i UV isikla donatilmis "laminar flow hood" içinde yapiniz. Kullanilmanin disinda UV isiklari açiniz. Hood içinde yalnizca PCR için kullanilan mikrotüpler; disposabl eldiven, pipetleri tutunuz. Otomatik pipetler çok sik kontaminasyon kaynagi olduklarindan; positive-displacement pipetleri ve tikaçli pipet uçlarini kullaniniz.
2. PCR reaksiyonuna baslarken, temiz bir eldiven giyiniz. Mümkünse eldivenleri sik sik degistiriniz.
3. Sarf malzemesini herkes kendisi için hazirlamali ve küçük hacimlerde saklamalidir. Bu malzemeleri baska amaçlarla kullanmayiniz. Bunlari hazirlarken tüm malzeme yeni ve steril olmalidir.
4. Sarf malzemelerini tasiyan mikrotüpleri açmadan önce kisaca santrifüjleyin. Bu eldivenlerin ve pipetlerin kontaminasyonuna engel olacaktir.
5. Reaksiyon tüpüne en son DNA eklenmelidir. Mineral oil'de buna dahildir. Evaporasyonu engellemek için mineral oil konur, ardindan DNA eklenir. Sonra tüp 10 sn. kadar santrifüjlenir.
6. Reaksiyon tüpüne DNA eklenirken; hava kabarciklari olusturulmamaya dikkat edilir.
7. Mümkün olursa bir pozitif kontrol, deneyde olmalidir. Bu pozitif kontrola laboratuarin uzak bir kösesinde de DNA örnegi eklenmelidir.
8. DNA disinda tüm PCR komponentlerini tasiyan negatif kontrol, deneyde olmalidir. Bu negatif kontrol tüm PCR reaksiyonu yapildiktan sonra yapilmalidir.
9. Wipe-testi: PCR yapilan bölgeden, kontaminasyon kaynagi olabilecek tüm alet,cisim,yer v.b. yerlerden küçük bir kurutma kagidi ile silinme ile elde edilecek örnekler PCR'a tabii tutulur. Kontaminasyon kaynaginin saptanmasi için kullanilan bir yöntemdir.
Sekil 7.17. Tanisal PCR'da kontaminasyon.
7.8.6. PCR HATALARI
7.8.6.a. PCR Carry Over: Birçok degisik yöntemle PCR "(tasinma)" kontaminasyonunun eliminasyonu önerilmistir. Bunlar UV irradiation (kisa dalga); gamma irradiation; psoralinin (isopsoralin) reaksiyona eklenmesi ve Uracil-N-glycosylase kullanilmasidir.
Sterilizasyonun etkinliginin belirli sinirliligi vardir. Baz uzunlugu ile bu etkinlik arasinda belirli bir iliski vardir. Örnegin 700 bp üzerindeki PCR ürünleri UV irradiationa daha duyarlidirlar. 250 bp altindakiler daha az duyarlidirlar. O nedenle PCR karisimi, Taq Polimeraz ve hedef DNA ortama eklenmeden önce UV-kisa dalga-irradiasyona tabi tutulur. Bu islem için, laboratuarlarda kullanilmak üzere "PCR-Is Ortami" denilebilecek kapali sistemler gelistirilmistir.
PCR ürünlerinin örnek DNA'dan ayrilmasini saglayan PCR reaksiyonlarinin önceden deoxyuridine triphosphate (dUTP)'nin deoxyythymidine triphosphate (dTTP) ile yer degistirmesi ve PCR ürününe birlesmesinin saglanmasina dayanan bir yöntem tanimlanmistir. Bu klasik olmayan nükleotidlerin varligi ile önceki PCR ürünü ile yeni olusan PCR ürünü birbirlerinden ayrilabilirler. Uracil-N-glycosylase (UNG) enzimi, reaksiyon ön karisiminda ilk PCR siklusundan önce var olabilecek önceki PCR ürünlerindeki urasilin eksizyonunu katalize eder. RNA, yeni PCR için kullanilabilir çünkü UNG, RNA'daki uracil'i yüksek isilarda kesmez. UNG yikimi sonrasi olusan, abazik polinükleotidler alkali solüsyonlarda ve yüksek isilarda hidrolize olmaya duyarlidirlar. Abazik polinükleotidler, bir DNA parçasi olarak fonksiyon göremezler çünkü DNA polimeraz fonksiyonu için beklerken bir aglycosidic linkage ilk PCR siklusunda yüksek denatürasyon isisi altinda baglanirlar. Ötesi, degrade modifie 3' terminal olusumlari, eger DNA polimeraz 3' eksonükleaz aktivitesi yoksa baglanamazlar. UNG, PCR isilari sirasinda inaktive olur ve sonuçta yeni PCR ürünleri birikmeye baslar (Sekil 7.18).
7.8.6.b. Yanlis pozitif reaksiyonlar: Taq Polimerazin (Dogal seklinde) kendisinde kontaminasyon vardir. Isinma döneminde en sik A=T ve G=C degisiklikleri olmak üzere hatalar olusur.
7.8.6.c. Artifisiel nokta mutasyonlari: Bazi gen dizilerinde (Ör. p53 CD 273) duragan sekonder yapi [stable secondary structure] oldugu takdirde; bu yapi nedeni ile, polimeraz lokal olarak zorlukla karsilasilir ve komplementer DNA dizisini dogru olarak sentezleyemez. O nedenle her yeni nokta mutasyonunun bulunmasi halinde; deneyler PCR'dan DNA dizi analizine kadar tekrarlanmalidir.
Sekil 7.18 PCR kontaminasyonunun UNG ile ortadan kaldirilmasinin sematik görünümü.
PCR karisiminin, PCR öncesi UV isiga tabi tutulmasi; kontaminasyonu ortadan kaldirir. 120 bp'lik bir dizinin 2x107 kopyasi 9 cm'lik bir uzakliktan -5 dk içinde harab olmasi UV ile saglanabilir. PCR Tamponu; dNTP ve kullanilan deionize suyun; kisa dalga UV radyasyona tabi tutulmasi tavsiye edilir. Ancak Taq polimeraz ve primerlarin UV'ye tutulmasi tavsiye edilmez. Çünkü aktivitelerini yitirirler.
PCR karisiminin, PCR öncesi, herhangi bir RE veya DNAse ile muamelesi ile de var olan DNA dizileri kesilerek ortadan kaldirilir. Ancak bu single-strand kontaminantlar için geçerli degildir.
Yeni primerler tasarimlanarak da PCR ürün kontaminasyonuna engel olunabilir. Bu sirada, yeni primerlar ilk primerlerden farkli bölgelere uygun olarak tasarimlanir.
Parafin bloktan PCR yapildiginda; DNA'daki asiri degradasyona bagli olarak; uygun olmayan bölge çogalarak hataya yol açar. Eger bölgede, RE kesim noktasi varken yok görünüyorsa, hata olabilecegi düsünülmelidir.
7.8.7. PCR KOMPONENTLERI:
7.8.7.a. Polimeraz Enzimleri: Polimerazlarla ilgili bilgiler 3.bölümde detayli olarak verilmistir.
7.7.a.i. PCR'da Kullanilan DNA Polimerazlarin Dogrulugu
Saflastirilmis DNA Polimerazlar, moleküler biyolojinin önemli araçlarindan birisidir. Herhangi bir uygulama için; en uygun DNA Polimerazin seçilebilmesi tümüyle var olan enzimler arasindaki biyokimyasal farkliliklarin bilinmesini gerektirmektedir. DNA Polimerizasyonunda en önemli nokta DNA polimerazin dogrulugudur. Yani her sentez edilen nükleotid basina olusan hata miktaridir.
PCR ortamindaki yüksek dNTP konsantrasyonlari, hata oranini arttirirken, düsük dNTP ve Magnesium konsantrasyonu hata oranini azaltir. PCR sirasinda, hizli isi çikis zamani ve kisa denatürasyon zamanlari, hata oranlarini minimale indirir.
Görülen mutasyonlar en sik A:T- G:C seklindedir. Bir çok organizmada dahi hata orani 10-9 ve 10-11 seklindedir ancak canli hücrelerde bunlari düzeltecek mekanizmalar mevcuttur.
DNA'nin, DNA polimerazlar araciligi ile sentezi; hem çok kompleks hem de önemli ölçüde sirali bir islevdir. Bu islevde deoxynucleotide triphosphate (dNTP) substrati DNA primer-template'ine serbest 3'-hydroxyl'ine eklenir. Bu sentez sirasinda, DNA polimerazin hatalari ayrimlayabilmesi için en azindan üç sansi bulunmaktadir. DNA polimerazin tüm dogrulugu bu üç stepdeki hata oraninin toplami ile tanimlanir. Bu hatalarin ayrimlanabilmesi, her adimda; polimeraza,lokal DNA dizisine ve baz uygunsuzluguna bagimlidir.
Ilk adim, DNA polimerazin, DNA dizisine sokulmak üzere gelen dNTP'yi ayrimlayabilme ve dogru nükleotidi diziye sokabilme yetenegidir.
A. Nükleotid sokulmasi: DNA sentezi sirasinda kompozisyon ve simetri açisindan potansiel baz uygunsuzlugu vardir. Bu fazda, hata orani 10-100 kat degiskenlik gösterebilir. Baz seçimindeki hata; ortamdaki her dört oligonükleoditin relatif konsantrasyonu ile de etkilenir. Deoksynükleotid havuzundaki dengesizlikler, mutajenik veya antimutajenik olabilir.
Ikinci adim; polimerazin "dogru çiftlendirilmis (paired) bir DNA parçasinda" oldugu kadar terminalde dogru çiftlendirilmis bir DNA parçasini da" sentez edebilme "extension" yetenegidir.
B. Mispair extension: Insertion fazinda oldugu gibi herhangi bir polimerazin "extention" orani; uygunsuz simetri, kompozisyon ve lokal diziye bagli olarak degisiklik gösterebilir.
Bazi DNA Polimeraz'larda 3'--5' eksonükleaz aktivitesi vardir. Bu özellik, "Proofreading" olarak tanimlanabilir. Proofreading , selektif olarak uygunsuz yapisan nükleotidleri; dogru olanla yer degistirme özellikleri tasirlar. Proofreading etkinligindeki degisiklikler; polimerizasyon ve eksizyon arasindaki dengeyi yansitir. Eger dNTP konsantrasyonu yüksek ise "proofreading" özelligi hasara ugrar. Nükleotid monofosfatlarin eklenmesi ile de "proofreading" özelligi azalir; bu da eksonükleaz aktif noktaya baglanarak-eksizyonu önleyerek gerçeklesir.
Serbest Magnesium (MgCl2) konsantrasyonun azalmasi ile Taq Polimeraz dogrulugu arttirilabilir. dNTP, DNA ve proteinlerin tümü Mg+2 ionunu bagladiklarindan; her PCR protokolunda Mg konsantrasyonu ampirik olarak ayarlanmalidir. Reaksiyon pH'si düsürüldügünde; Taq polimerazin hata orani azalir. Hatalar, Taq polimeraz reaksiyonu Tris; 4-morpholine- ethane-sulphonic acid (mes) ve 1.4- piperazinebis (ethane-sulphonic acid) (pipes) tamponlari ile yapilirsa azalir. (pH 5-6; 70°C); pH 8.2'ye dogru çiktikça hata orani artmaktadir. Her üç ünitlik pH degisikliginde; nokta mutasyonu hata orani 60 kat; Frameshift hata orani ise 11 kat artis gösterir (Tablo 7.1).
Tablo.7.1. PCR sirasinda kullanilan DNA Polimerazlarin dogrulugu.
(Hata orani)
DNA 3'Æ5' Eksonükleaz Mutant sikligi Baz mutasyonu Frameshift
Polimerase aktivitesi 104
T4 + 8 1/80000 1/260000
Klenow + 11 1/170000 1/1.5x106
Taq - 110 1/9000 1/41000
Tth - 130 önemsiz önemsiz
Polimeraz, PCR'da kullanilirken su noktalara dikkat edilmelidir:
Her enzim, kendisine uygun tamponda kullanilmalidir.
Serbest magnesiumu etkileyen faktörler sunlardir:
- DNA örnegi
- Örnekde selasyon yapan ajanlarin olmasi: EDTA/Sitrat
- dNTP
- Protein
- Fazla Mg, enzimin spesifikligini azaltir. Azi, enzimin inaktif olmasina yol açar. Mg solüsyonu, eritildikten sonra vortekslenir. Bu uniform bir solüsyon elde etmek için yapilir. Basit ama gereklidir. Çünkü MgCl2 çöker.
- Taq polimeraz miktari önerildigi miktarda olmalidir. Fazla konulmasi ile
1. Olusan PCR ürünlerinin miktari artmaz.
2. Artefakt olusmasini arttirir.
7.8.7.b. Oligonükleotidler: PCR ürünleri kör uçlu DNA molekülleri olup; bakteriofaj T4 polinükleotid kinaz araciligi ile fosforla isaretlenebilir Ayni zamanda, bu ürünler klasik teknikler kullanilarak, klonlanabilir. Ancak, nedeni bilinmemekle beraber; bu ürünlerin klonlanmasi normalden daha azdir. Bu soruna bir çözüm, 5' uçlarinda primerlerin bir RE tanima bölgesinin olmasidir. Bu seçilen RE'de memeli DNA'sini seyrek kesen enzimlerden olmalidir.
Oligonükleotidler PCR'da genellikle 1uM konsantrasyonda bulunurlar. Bu miktar genellikle, 30 siklusluk bir PCR için yeterlidir. Yüksek konsantrasyonda olmalari halinde; ektopik noktalara yapisma olabilir ve böylece istenen hedef DNA disinda bölgelerde çogalmaya baslar. Eger yeterli konsantrasyonda degilse; bu takdirde PCR ürünü çok azdir. Oligonükleotid yapimi, bu is için gelistirilmis "otomatik cihazlar" ile sentezlenirler. Bu cihazlar 100 nükleotide kadar sentez yapabilecek niteliktedir. Üretim miktari -nanomole- düzeyindedir. Modern cihazlarla sentez edilen kisa oligonükleotidler özellikle daha öteye saflastirilmadan kullanilabilir, ancak uzun oligonükleotidler söz konusu ise Poliakrilamid gel elektroforezi gerekebilir. Bu özellikle mRNA'nin 5' sonunu haritalamak için primer- uzamasi yapilacak ise gereklidir. Oligonükleotidler genellikle liyofilize toz olarak satin alinirlar:
1. Bir ml steril-filtre edilmis su içinde, bir steril mikrofüj tüpde eritilir. Solüsyon, vortexlenir. Bu solüsyon siklikla hafif bir bulaniklik gösterebilir. Bunun nedeni insoluble benzamidlerin ortamda bulunmasidir.
2. Oda isisinda 5 dk süreyle 12.000 g'de santrifüj edilir. Supernatant, steril bir mikrosantrifüj tüpe aktarilir.
3. Solüsyon, 3 kez 400 ul n-butanol ile ekstrakte edilir. Her ekstraksiyondan sonra; üstteki organik faz atilir. Bir evaporatörde kurutulur. Altta sari-krem beyazi bir toz kalir. Tekrar 200 ul steril su ile eritilir.
7.8.7.b.i. PCR Primer Setlerinin Optimizasyonunda Strateji:
PCR primer setlerinin optimizasyonunda izlenecek strateji Tablo 7.2'de gösterilmektedir. Oligonükleotidleri net olarak görünür hale getirebilmek için yapilmasi gereken Poliakrilamid jel elektroforez konsantrasyonlari su sekildedir:
PCR Primer Tasarimda Genel Kurallar
Optimal Deger
1. Oligonükleotid dizisi "özgün" olmali
2. 3'ucunda G.C olmali 1-2G/C nükleotidi
3. Baz dagilimi ve kompozisyonu rastgele olmali G/C % 45-55 olmali
4. Primer uzunlugu 18-25 baz
5. Iki primer araligi-kompozisyonu 100-600 bç
6. Uygun TM olmali
7. Primerin kendisinin -ve/veya antisense primeri komplementer olmamali
Bilgisayar araciligi ile özel olarak tasarimlanmis programlarla da "primer" tasarimlamak mümkündür.
Primerin molar miktarini tahmin etmek için, var olan nükleotid sayisini 0,33 ng ile çarpmak yeterlidir.
Örnek: 1 picomole 24 bazlik oligodeoxynükleotid ne kadar nanogramdir? (0,33 x 24= 7,92 ng)
Oligonükleotid uzunlugu % Polyakrilamid
25 den az 19
25 - 45 15
45 - 100 12
7.8.7.b.ii.Oligonükleotidlerin Fluoresant Boyalarla Isaretlenmesi:
DNA'nin Fluoresant maddelerle isaretlenmesi random- priming, Nick translation, terminal deoksinükleotidil transferazla ekleme ve polimeraz zincir reaksiyonu yöntemleri araciligi ile yapilabilir.Tetramethylrhodamine ile oligonükleotidler isaretlenerek tanida kullanilabilir. Özellikle tek baz degisimli mutasyonlarin belirlenmesinde çok önemli avantaji göze çarpmaktadir. Ayrica kompetitif PCR'da da kullanma alani bulunmaktadir.
7.8.7.b.iii. "MELTING TEMPERATURE" hesaplanmasi:
Hedef diziye tam uyan bir oligonükleotid kullanirken; basitçe "MELTING TEMPERATURE" (erime isisi) hesaplanmasi ile hibridizasyon kosullari belirlenebilir. 18 nükleotid'den daha kisa oligonükleotidler için Tm su sekilde hesaplanabilir. Her A ve T için 2°C; her G ve C için 4°C - bunlarin toplanmasi Tm'i verir. Ancak bu yaklasim uzun oligonükleotidler için uygun olmaz. O zaman Fritsch'in yaptigi bir formül kullanilabilir:
Tm= 81.5 - 16.6 (Log10 [Na+] + 0.41 (% G+C)-(600/N)
(N: zincir uzunlugu)
Tablo 7.2 PCR Primer Setlerinin Optimizasyonunda Strateji
Reaksiyondaki degisken Test edilecek aralik Test bazinda degisim
Annealing isisi 45-62°C 2-3°C
Taq Polimeraz 0.5-3.0 ü/reaksiyon 0.5 ü/100 ml reaksiyon
Mg++ konsantrasyonu 1.25-3.0 mM 0.25 mM
Primer konsantrasyonu 0.2-2.0 mM 0.5 mM
7.8.7.c. PCR'da Kullanilan Tamponlar: Standart PCR tamponu 50 mM KCl, 10 mM Tris.Cl (oda isisinda pH 8.3), 1.5 mM MgCl2 ihtiva eder. 72°C'de inkübe edildiginde pH yaklasik 7.2'ye düser. Divalent katyonlarin ortamdaki varolusu çok önemlidir. Magnesium ionlari Mangan'a göre daha etkindir ve kalsium ionlari ise inefektiftir. Mg+2'un optimal konsantrasyonu oldukça düsük oldugundan (1.5 mM); DNA hazirlanisinda yüksek konsantrasyonda selasyon yapici ajanlarin bulunmamasi (EDTA) gerekir. Ayrica fosfatlar gibi negatif yüklü iyonik gruplarda (dNTP) olmamalidir. O nedenle DNA 10 mM Tris.Cl (pH 7.6); 0.1 mM EDTA (pH 8.0) içinde çözülmelidir.
Bir PCR ilk kez kuruldugunda Mg+2 konsantrasyonu optimizasyonu saglamak için ayarlanmalidir. Burada Tris.Cl (10 mM) ve KCl (50 mM) olarak sabit tutulup; MgCl konsantrasyonu 0.05-5 mM arasinda (0.5 mM artisla) denenir. PCR'da Mg Konsantrasyonunun etkiledigi komponentler sunlardir:
1. Primer Yapismasi
2. PCR ürünü ve template'lerin dissosiasyonu (birlesip ayrilmalari)
3. PCR ürününün spesifitesi
4. Primer-dimer artefaktlarin olusmasi
5. Taq polimeraz enzim aktivitesi (Taq-polimeraz enziminin çalisabilmesi için serbest Mg olmasi gereklidir.)
dNTP'ler, her dNTP için 200 mM konsantrasyonda olacak sekilde kullanilir. Bir dNTP stock solüsyonun (50 mM) pH'si 1 N NaOH ile pH'si 7.0 olacak sekilde ayarlanir.
Reaksiyon üzerine mineral oil eklenir. Bu örnegin evaporasyonuna engel olur. Bu yagdan kloroform ile kurtulunur. Aquöz faz, amplifiye DNA'yi tasimaktadir.
7.8.7.d. Hedef Diziler: DNA, PCR reaksionuna tek veya çift zincirli olarak eklenebilir. DNA'nin uzunlugu bir önemli faktör olmamasina karsin; eger DNA'yi seyrek olarak kesen (Sal I veya Not I) bir RE ile kesilirse, o takdirde sonuç daha basarili olabilir.
DNA, eger kapali sirküler formlar tasiyorsa, PCR daha az etkili olur. O nedenle, PCR öncesi DNA'yi linearize etmek gerekmektedir. PCR reaksiyonu için gerekli olan DNA miktarini ayarlamak her zaman mümkün olmayabilir, o takdirde seri halde DNA konsantrasyonlari hazirlanabilir.
7.8.7.e. Isi: Taq Polimeraz 50°C'lik isi üzerinde incelendiginde 23- 30°C Æ 70-80 °C arasinda arttikça; ortaya çikacak hata orani artar. DNA'nin yüksek isi ve düsük pH'da inkübasyonu; DNA hasarina yol açar, bu da potansiel mutasyon olasiligini arttirir. En sik görülen DNA hasar sekli sitozinin urasil olusturacak sekilde deaminasyonudur. Urasil, timin ile ayni kodlama potansiyeline sahip oldugundan; urasil'in DNA polimeraz ile replikasyonu; C.G Æ T.A transition (geçis) mutasyonuna yol açar. PCR'da sitozin deaminasyonunun olusma riski; en çok denatürasyon basamagindadir. Sitozinin deaminasyonunun orani tek iplikçi DNA'da 80°C'de 1x10-8/sn; 95°C'de 2x10-7/sn'dir.
Ikinci tip DNA hasari; N-glycosylic baglarin hidrolizi sonucunda spontan base release (serbest kalisi) ile olusur. Bu hidrolitik reaksiyon orani; önemli ölçüde, yüksek isida ve düsük pH'da artar. DNA'nin depürinasyonu pH 7.4 ve 70°C'de yaklasik 4x10-9/sn oraninda olusur. Depirimidinasyon ise 20 kez daha yavastir (2x10-10/sn ve 80°C). Pirimidin salinimi, 95°C'ye dogru isi arttikça, artar. Benzer olarak depürinasyon, isi arttikça artis gösterir. pH'nin düsürülmesi ile de spontan pürin kayip oranini arttirir. Bu spontan baz hidrolizi; DNA'da apürinik/apirimidinik (AP) noktalarin olusmasina yol açarak, DNA Polimeraz sentezini inhibe eder. Bazi olgularda, DNA polimerazlar bu AP noktalarini tamir edebilir. Bu nedenle, PCR inkübasyon sürelerinin yüksek isilarda minimumda tutulmasi uygundur.
7.8.7.f. Siklus Sayisi: PCR siklus sayisinin arttirilmasi ile de hata orani artar. Örnegin 20 siklusda 1/10000 hata orani "1000 nükleotidde 1" iken; bu 50 siklusda 2.5 x 10-3 veya 1/400 nükleotid düzeyine çikar. Bu hata sikligi, asagidaki formülle hesaplanabilir.
Bu kaba bir yaklasimdir. Çünkü dizide olusabilecek bir hata, PCR sonuna kadar ayni sekilde/sayida kalabilecegi gibi; bir kumar makinasinda oldugu gibi artis da gösterebilir.
Bir PCR reaksiyonunda 25-30 siklus yeterlidir. Bu siklus sayisinin üzerinde çalisildigi takdirde, Taq DNA Polimerazin miktari azalmaktadir. Amplifikasyon 37°C'de çok daha iyi olmasina karsin; "mispriming" (yanlis baglanma) önemli ölçüde artar. 50°C'de ise mispriming azalir, spesifite artar ama PCR ürün miktari daha azdir. Uzama için her kb için 1 dk'lik süreç yeterlidir.
7.8.8. dNTP
Serbest doexyribonucleotid trifosfatlara DNA sentezi sirasinda ihtiyaç bulunmaktadir. dNTP'lerin, bir PCR reaksiyonu sirasinda, optimal spesifikligi saglamak üzere konsantrasyonu 200 um düzeyinde olmalidir. dATP, dGTP, dCTP ve dTTP'nin konsantrasyonlarinin birbirine esit olmasi gereklidir. 50 um'in üzerindeki bir son konsantrasyon, Taq DNA polimeraz aktivitesini baskilar. Ardarda yapilacak dondurma-çözdürme islemleri, dNTP'nin raf ömrünü kisaltacagindan; dNTP'ler kullanilacak miktarlar kadar ayrimlanip, derin dondurucularda (-20°C) saklanmalidir.
7.8.9. KISA PCR ÜRÜNLERININ ELDE EDILMESININ
IYILESTIRILMESI
PCR tipik olarak 93-95° arasinda denatürasyon isisiyla baslamaktadir. Bu isi her siklusda meydana gelir. Bu sartlar altinda Taq DNA polymerase giderek inaktive olur. Taq DNA Polimerazin, yari ömrü 92.5°'de 130 dk; 95°C'de 40 dk'dir. Bu nedenledir ki PCR'in sonlarina dogru olan sikluslarda aktivitesi sinirlanmaktadir. Amplifikasyon ürünü devam eden sikluslarda baslatici olarak görev yaptigindan; daha sonraki sikluslarda bu kadar yüksek denatürasyon isisi kullanmak gerekmeyebilir.
Kisa PCR ürünlerinde ilk bir kaç siklusdan sonra (en az bes-on siklus); denatürasyon isisinin 87-90°C'ye indirilmesi ile elde edilecek ürün miktari artar. Bu durumda siklus sayisini da 40-50-60-70'e çikarmak mümkün olacaktir; bu da elde edilecek ürün miktarinin artmasini saglayacaktir.
Ancak eger PCR ürünü zaten fazla ise diger sinirlayici etmenlerin (primer bitmesi; nükleotid veya pirofosfat konsantrasyonlari) devreye girmesi ile farklilik olusmayacaktir.
7.8.10. PCR INHIBISYONU:
PCR, bazi nedenlerle inhibe edilebilir. Bunlar söyle siralanabilir:
1. Ortamda RNA düzeyinin yüksek olmasi. (Ortama eger, RNase eklenirse, elde edilecek PCR ürün miktari artis gösterir.
2. EDTA'nin yüksek konsantrasyonda olmasi, PCR'i Mg'u baglamasi nedeni ile inhibe eder.
3. Heparinin ortamda bulunmasi, PCR'i inhibe eder.
4. Ortamda fenol kalintisinin bulunmasi PCR'i inhibe eder.
5. DMSO'nun ortamda %10 konsantrasyonda olmasiyla, PCR %50 oraninda inhibe olur.
6. Urasil konsantrasyonunun yüksek olmasi
7. Uzun süre UV isiga maruz kalan "mineral oil", PCR'i inhibe eder.
8. PCR komponentlerinin konuldugu tüplerin yapisi da PCR etkinligini etkiler.
9. Upstream nokta mutasyonlari ile DNA'da kompresyon olusabilir, bu da PCR olusumunu engelleyebilir. Bu özellikle, mikro delesyon ve/veya insertionlarin oldugu durumlarda ortaya çikabilir.
7.8.11. PCR ÜRÜN MIKTARININ VE ÖZGÜNLÜGÜNEN
ARTTIRILMASI
7.8.11.a. PCR amplifikasyonunu arttirmak için CoSolvent kullanimi: PCR amplifikasyonu hedef DNA'daki G/C zengin bölgelerin ve sekonder yapilarin bulunmasiyla menfi yönde etkilenmektedir. Insanlarda infeksiyon yapan Sitomegalovirus (CMV) / herpes simpleks 1-2'de G/C zengin bölgelerin orani yüksektir (sirasiyla %55 ve %65). O nedenle bu viruslar PCR için zor örneklerdir. PCR'i kolaylastirmak için, PCR ortamina bazi maddelerin eklenmesi ile (cosolvent) PCR'da elde edilen ürün miktari arttirilmistir. Bu maddelerin konsantrasyonlari primer bölgele
